脊髓損傷(SCI)會產生以損傷相關分子模式(DAMP)和免疫細胞激活為特征的炎癥微環境，這會加劇繼發性損傷并損害神經功能恢復。此外，受損脊髓中巨噬細胞的發生不平衡極化。促炎性M1表型巨噬細胞的激活水平持續升高，而潛在的修復性M2表型巨噬細胞的激活水平降低，導致炎癥持續時間延長和組織重塑失敗。另一方面，SCI炎癥微環境不利于神經干細胞的存活、遷移和分化，嚴重阻礙了內源神經干細胞/前體細胞在損傷后的軸突生長及神經分化再生作用，影響損傷區神經網絡的重建以及功能的恢復。因此，重建SCI免疫炎癥微環境對提升脊髓再生修復的效果十分關鍵。
圖1：一種免疫調節性水凝膠支架促進脊髓損傷后神經再生的示意圖
左：用陽離子聚合物聚(酰胺胺)和抗炎細胞因子IL-10修飾的光交聯明膠水凝膠。該支架在體外促進M2巨噬細胞極化和神經元分化。右：移植雙功能免疫調節支架到到小鼠脊髓損傷部位，在此清除DAMPs，減少炎癥，并增強組織重塑和神經再生。
圖2：水凝膠支架的表征
(A)為GL(明膠)、Scav-GL(明膠+PAAM-G3)、Delv-GL(明膠+IL-10) 和 Scav/Delv-GL(明膠+ PAAM-G3+ IL-10) 支架的掃描電鏡圖像，圖像表明所有支架的孔徑相似，孔徑為60-180μm。(B)支架的壓縮模量。(C)水凝膠支架7、14、21和28天的體外降解率。(D)DAMP溶液中總蛋白質的清除百分率。(E)HMGB1和(F)細胞外DNA的水平在SCAV-GL支架孵育后的水平。(D-F)表明用含有PAAM-G3的支架處理后，無細胞DNA(cfDNA)和HMGB1蛋白(陰離子DAMP)的量以及溶液中總蛋白的量減少。(G)一天后，Delv-GL和Scav/Delv-GL水凝膠分別釋放了大約24.4%和23.7%負載的IL-10，隨后IL-10逐漸釋放，IL-10在SCAV/Delv-GL支架中釋放21d的比例約為52.4%。在水凝膠中加入PAMAM-G3對IL-10的緩釋行為無明顯影響。
圖3：Scav/Delv-GL支架對巨噬細胞和小膠質細胞促炎活性的調節
(A)白介素(IL-1β)， (B) TNF-α和(C) iNOS在經DAMPs刺激和PBS, GL, Scav-GL, Delv-GL或Scav/Delv-GL支架處理后M1極化RAW264.7細胞中的定量表達。(D)iNOS的免疫熒光染色，Scav /Delv-GL組中iNOS陽性染色的細胞數量減少。(E)IL-1β、(F)TNF-α 和(G)iNOS的基因表達水平。(H)在 DAMPs 刺激后用 PBS、GL、Scav-GL、Delv-GL 或 Scav/Delv-GL 支架處理M1極化BV2細胞的iNOS的免疫熒光圖像。表明Scav/Delv-GL治療組的iNOS表達顯著低于所有其他組。這些結果表明，免疫調節支架(Scav-GL，Delv-GL和Scav / Delv-GL)顯著抑制DAMP誘導的巨噬細胞和小膠質細胞中的促炎反應。
圖4：Scav/Delv-GL支架在神經元分化中的作用
對神經特異性分化標志物微管蛋白(Tuj-1)進行免疫染色的圖像(神經元：Tuj-1，綠色;細胞核：DAPI，藍色。)。在將DAMPs添加到神經源性分化培養基后，觀察到的Tuj-1陽性細胞很少，這表明DAMPs對神經發生的抑制作用。空白水凝膠(GL)并沒有減輕 DAMPs 對NSCs的影響。Scav / Delv-GL和Scav-GL組中Tuj-1陽性神經細胞的數量顯著升高，表明神經源性分化更大。Delv-GL組中暴露于DAMPs的Tuj-1陽性細胞數量也有所增加，但分化程度低于Scav / Delv-GL和Scav-GL治療組。
圖5：在急性期，Scav / Delv-GL支架的植入減少了促炎細胞因子的表達，并減少了病變部位的巨噬細胞和小膠質細胞的數量
(A)為SCI后第7天對照組，GL組，Scav-GL組，Delv-GL組和Scav / Delv-GL組脊髓組織中炎癥細胞因子水平變化的熱圖分析， Scav / Delv-GL組中促炎細胞因子的濃度顯著降低。(B)各組SCI小鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α表達的圖像，(C-D)為(B)中各組的定量分析。(E-J)通過免疫染色觀察SCI急性期病變區巨噬細胞和小膠質細胞的分布和免疫表型，檢測ED1(反應性小膠質細胞/巨噬菌體標志物)，F4/80(巨噬細胞標志物)和Iba-1(小膠質細胞標志物)的表達。圖像顯示Scav/ Delv-GL組的陽性染色巨噬細胞和小膠質細胞的數量顯著低于其他四組。結果表明在脊髓損傷部位植入Scav/Delv-GL和Scav-GL支架可減少急性期促炎細胞因子的分泌。
圖6：Scav/Delv-GL支架植入調節炎癥細胞亞型
(A-D)損傷后7天對照組、GL、Scav-GL、Delv-GL和Scav/Delv-GL組中iNOS 和ARG-1的免疫熒光染色圖像與定量分析。iNOS(M1型)和ARG-1(M2型)。圖像表明，損傷后第7天，Scav/Delv-GL組和Scav-GL組損傷部位和周圍組織區域iNOS陽性細胞數量明顯低于對照組和GL組。在損傷區域植入水凝膠支架，特別是Delv-GL支架增加了ARG-1陽性細胞的數量，這表明Scav / Delv-GL支架調節了SCI急性期受損脊髓中巨噬細胞和小膠質細胞的M1 / M2極化。
圖7：病變部位的長期炎癥反應
(A-C)手術后 8 周，對照組、GL、Scav-GL、Delv-GL 和 Scav/Delv-GL組中的IL-1β和TNF-α表達水平和ED1、F4/80和Iba-1免疫熒光染色。結果表明Scav-GL組、Delv-GL組和Scav/Delv-GL組IL-1β和TNF-α的表達水平低于未處理的對照組和GL組。此外，在植入Scav / Delv-GL支架的小鼠受損組織的中心區域發現的ED1，F4 / 80和Iba-1陽性細胞明顯少于其他四組。結果表明，免疫調節功能支架，特別是 Scav/Delv-GL支架，減弱了長期的促炎反應，因此有助于減少 SCI 后慢性期的炎癥微環境。這些結果表明，免疫調節功能支架，特別是 Scav/Delv-GL支架，減弱了長期的促炎反應，因此有助于改善SCI后慢性期的炎癥微環境。
圖8：神經再生和功能恢復
(A)SCI第7天各組小鼠病變部位的Tuj-1陽性軸突熒光染色。圖像表明，在手術后七天，Scav / Delv-GL和Delv-GL組中Tuj-1陽性新生成的神經元數量高于Scav-GL，GL和未治療的對照組。(B-C)：病變中心的Tuj-1陽性細胞和術后8周對照各組中脊髓組織樣本的MAP2表達水平。(D-F)術后8周各組后肢的運動誘發電位(MEPs)響應于大腦的電刺激。觀察到用Scav / Delv-GL支架治療的小鼠(平均潛伏期3.39 ± 0.06毫秒；平均MEP振幅0.14 ± 0.02 mV)治療的小鼠的運動誘發反應比用Scav-GL處理的小鼠(平均潛伏期4.28±0.84毫秒；平均幅度0.12 ± 0.05 mV)或Delv-GL(平均潛伏期4.17 ± 0.79毫秒；平均幅度：0.11 ± 0.04 mV)更大。(G)為不同組小鼠后肢野外行走得分(BMS)評分。這些結果表明，DAMP 清除和 IL-10 緩釋對于 SCI 模型中的長期運動功能恢復都很重要。
【總結】
在脊髓損傷中，病變部位及其周圍的免疫微環境在神經再生和功能恢復中起著重要作用。這篇文章開發了一種清除DAMP并緩慢釋放 IL-10的雙功能免疫調節支架，該支架可減少促炎細胞，同時增強抗炎細胞反應，加速神經再生，并改善運動的長期恢復體內功能。
